quimica forense
diego rinaldi
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28.08.2012 | Laboratorio Nš1
A cargo de: Lucre Bogado - Polo Espindola

 

                                                    Laboratorio Nº1

 

Tema: Recepción de muestras. Pretratamiento y extracciones en diferentes muestras para el estudio de Tóxicos orgánicos fijos.

 

Objetivos:

 

-          Conocer el manejo del Laboratorio Forense

 

-          Aprender los requisitos básicos para la recepción de muestras.

 

-          Procesar  muestras sólidas y líquidas más comunes en la rutina del laboratorio.

 

-          Realizar extracciones para el estudio de diferentes clases de tóxicos.

 

 

 

RECEPCIÓN DE LA MUESTRA:

 

Durante la autopsia, el médico forense recolecta muestras para realizar la prueba pericial que tiene por objeto establecer si existen elementos o compuestos de interés toxicológico.

 

Con este fin se reciben las muestras en frascos de plástico herméticamente cerrados y debidamente rotulados en la tapa con el número de autopsia a la cual pertenece la muestra. Estos frascos contienen un número de precinto que es único para cada autopsia junto con las muestras se recibe el pedido medico. Se debe controlar la correspondencia con los datos del pedido (número de autopsia y precinto), así como que las muestras sean las adecuadas para los análisis solicitados para evitar problemas a futuro.

 

La cadena de custodia asegura la inviolabilidad, identidad y trazabilidad de las muestras remitidas al laboratorio. Nos asegura que la muestra no fue alterada, sustituida o manipulada previamente a su llegada al laboratorio. Por lo que la persona que recibe la muestra debe ser muy cuidadosa, ya que ella será responsable si llega a ocurrir algún inconveniente. Se debe anotar cualquier detalle que pueda ser de utilidad o que pueda interferir en el análisis, como si la muestra posee cámara de aire, si no cumplió con la cadena de frío; así como también las cantidades aproximadas de cada una.

 

La muestra correcta para realizar el análisis debe estar sin conservantes. La muestra de sangre debe estar en tubos cerrados sin cámara de aire.

 

El análisis puede complicarse por los cambios químicos normales que ocurren durante la descomposición de un cadáver. La autopsia y el análisis toxicológico deben iniciarse tan pronto como sea posible después de la muerte. Los procesos de descomposición enzimáticos y no enzimáticos naturales y el metabolismo microbiano pueden destruir un tóxico que estuvo presente en el momento de la muerte, o producir sustancias o compuestos con propiedades físicas y químicas similares a las de tóxicos que se encuentran con frecuencia. 

 

PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA:

 

Las muestras más comunes con las  que se trabajan en el laboratorio forense son: Orina, sangre, hígado y contenido gástrico.

A la sangre y orina no se les realiza tratamiento previo a la extracción, es decir no requieren procesamiento a diferencia del hígado y contenido gástrico.

 

 

MUESTRA: HÍGADO

 

MÉTODO: MOLIENDA

 

 

 

FUNDAMENTO DEL MÉTODO: La molienda tiene por objetivo crear una muestra lo más homogénea posible. El agregado de ácido tartárico es para retener posibles tóxicos, en forma de tartratos y el sulfato de sodio anhidro es para retener el agua libre.

 

 

 

MATERIALES UTILIZADOS:

 

- Procesadora.

 

- Espátulas.

 

- Bisturí

 

- Pinzas

 

- Vasos de liofilización.

 

REACTIVOS UTILIZADOS:

 

- Ácido tartárico (polvo).

 

- Sulfato de sodio anhidro (polvo).

 

 

 

PROCEDIMIENTO:

 

- Se trasvasa la mitad de la muestra al recipiente de la procesadora. La otra mitad se conserva en heladera para el caso que fuese necesario repetir algún procedimiento.

 

- Se agrega ácido tartárico (punta de espátula).

 

- Se agrega sulfato de sodio anhidro. La cantidad agregada de éste reactivo debe  ser aproximadamente  igual a la cantidad de muestra.

 

- Se procede a procesar la muestra a velocidad máxima hasta obtener una muestra homogénea (aspecto de picadillo).

 

- La muestra procesada se coloca en el vaso de liofilización., rotulado previamente.

 

- Tapar.

 

- Llevar al freezer (-20°C) durante 24hs.

 

 

 

MUESTRA: CONTENIDO GÁSTRICO

 

 

 

No se realiza la molienda. La muestra se trasvasa al frasco del liofilizador, se agrega ácido tartárico y sulfato de sodio anhidro (en las mismas proporciones señaladas para hígado). Se homogeiniza y se lleva al freezer (-20°C) durante 24hs.

 

En caso de que el contenido gástrico sea más líquido que sólido se procede a realizar la extracción directamente como en orina y sangre, sin procesamiento previo.

 

Cuando es una mezcla sólido- líquido, se debe separar las partes y tratarlas a cada una por separado según corresponda como se explicó anteriormente.

 

 

 

LIOFILIZACIÓN:

 

(para muestras de hígado y contenido gástrico)

 

 

 

FUNDAMENTO DEL MÉTODO: La liofilización está basada en el fenómeno físico de la sublimación del agua de la muestra, asegurando su estabilidad. El liofilizado acelera el proceso de secado del material aumentando la eficiencia del proceso. El liofilizador trabaja a -40°C y 50 torr aproximadamente

 

 

 

MATERIAL UTILIZADO:

 

-          Liofilizador. Modelo TFD5503. Marca SIUI.

 

-          Vasos para liofilización.

 

 

 

PROCEDIMIENTO :

 

 

 

- Prender el equipo y bajar la temperatura hasta -40°C aproximadamente.

 

- Prender la bomba de vacío para disminuir la presión del equipo.

 

- Una vez alcanzadas las condiciones deseadas (-40°C y 50torr) insertar las muestras de a una por vez y secarlas durante 24hs.

 

- Transcurrido el tiempo de secado necesario se procede a la extracción.

 

 

 

 

 

EXTRACCIÓN SECUENCIAL:

 

 

 

FUNDAMENTO DEL MÉTODO: Se realiza la extracción del tóxico de la matriz en la que se encuentra con el objetivo de poder identificarlo posteriormente y cuantificarlo de ser posible..

 

 

 

 MUESTRAS:   HIGADO Y CONTENIDO GASTRICO

 

 

 

MATERIALES UTILIZADOS:

 

- Ampollas de decantación.

 

- Cristalizadores.

 

- Lana de vidrio.

 

- Tiras reactivas para medir pH.

 

- Materiales para rotular.

 

 

 

REACTIVOS UTILIZADOS:

 

- Amoníaco.

 

- Cloroformo.

 

- Éter de petróleo.

 

- Éter sulfúrico (éter etílico).

 

 

 

PROCEDIMIENTO:

 

 

 

1)Si se sospecha de plaguicidas:

 

- En ampolla de decantación se agregan unas hebras de lana de vidrio.

 

- Se agrega el liofilizado molido.

 

- Se agrega éter de petróleo 10 ml o lo necesario para que la muestra quede cubierta por el solvente. Dejar en contacto 15 minutos, agitando de manera envolvente periódicamente.

 

- La fase liquida obtenida se recoge en un cristalizador debidamente rotulado.

 

- Llevar bajo campana para evaporar a sequedad.

 

 

 

Obtendremos aquí la mayoría de los plaguicidas organoclorados, organofosforados, carbámicos y piretroides.

 

 

 

 

 

2) Si no se sospecha de plaguicidas no se realiza el paso mencionado anteriormente. Se realiza la extracción ácida/neutra:

 

- En ampolla de decantación se agregan unas hebras de lana de vidrio.

 

- Se agrega el liofilizado  molido (Si ya se realizó la extracción con éter de petróleo, en la misma ampolla se realizan las posteriores extracciones).

 

- Se agrega éter sulfúrico, aproximadamente 10ml o lo necesario para que la muestra quede cubierta por el solvente. Dejar en contacto 15 minutos, agitando de manera envolvente periódicamente.

 

- El líquido obtenido trasvasar a un cristalizador debidamente rotulado.

 

- Llevar bajo campana para evaporar a sequedad.

 

Obtendremos aquí sustancias como salicilatos, barbitúricos, hidantoínas, glutetimida, meprobamato, benzodiazepinas, carbamatos, dicumarínicos, etc.

 

 

 

c) Luego se realiza la extracción alcalina:

 

- En la misma ampolla que contiene el material liofilizado que ya ha sido sometido a los procesos de extracción anteriores se agrega aproximadamente 10ml de cloroformo o lo necesario para que la muestra quede cubierta por el solvente y amoníaco hasta pH=9-10 (controlar con tira reactiva).

 

- Dejar en contacto 15 minutos, agitando de manera envolvente periódicamente.

 

- El líquido obtenido debe purificarse de la siguiente manera:

 

Obtendremos aquí sustancias como alcaloides en general, cocaína y sus metabolitos, anfetaminas, benzodiazepinas, fenotiazinas, atropina, antidepresivos tricíclicos, estricnina, morfina y otros alcaloides del opio, etc.

 

 

 

 MUESTRAS: SANGRE Y ORINA:

 

 

 

La extracción de los tóxicos presentes se realiza en columnas en fase sólida . Se basa en la interacción entre los componentes de la muestra con las moléculas adheridas a la columna (fase estacionaria).

 

 

 

MATERIALES UTILIZADOS:

 

Columna de Extrelut NT3 y NT20.

 

Cristalizadores.

 

Tiras reactivas para medir pH.

 

 

 

REACTIVOS UTILIZADOS:

 

Ácido tartárico.

 

Amoníaco.

 

Cloroformo.

 

Éter sulfúrico (éter etílico).

 

 

 

PROCEDIMIENTO:

 

Para la muestra de orina generalmente se utilizan columnas de 20ml de capacidad (NT20) por separado para cada extracción, esto si la muestra de orina es suficiente, sino se utilizan las NT3.

 

Para la muestra de sangre se utilizan columnas de 3ml de capacidad (NT3) por separado para cada extracción.

 

 

 

Extracto Neutro: Verter  20 ml o 3 ml de la muestra según corresponda al tipo de columna. Deja en reposo 20 minutos aproximadamente hasta que todo el líquido tome la columna y agregar 15 ml de éter de petróleo. La fase líquida obtenida se recoge en un cristalizador debidamente rotulado. Llevar bajo campana para evaporar a sequedad.

 

 

 

Extracto ácido: acidificar la porción de orina/sangre disponible a pH=3 con ácido tartárico (se controla el pH con tira reactiva). Verter en la columna. Se deja en reposo 20 minutos y se agrega 15ml de éter etílico.  La fase líquida obtenida se recoge en un cristalizador debidamente rotulado. Llevar bajo campana para evaporar a sequedad.

 

 

 

Extracto alcalino: alcalinizar la muestra de orina/sangre a pH=9-11 con amoníaco (se controla el pH con tira reactiva). Verter en la columna. Se deja en reposo 20 minutos y se agrega 15ml de cloroformo . La fase líquida obtenida se recoge en un cristalizador debidamente rotulado. Llevar bajo campana para evaporar a sequedad.

 

 

 

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