quimica forense
diego rinaldi
FaCENA / UNNE
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07.10.2012 | lab Nš3
A cargo de: Lucre-Polo

                                                    Laboratorio Nº3

 

 

 

Tema: Alcoholemia. Determinación de semen

 

Objetivos:

-         Conocer las diferentes técnicas cualitativas y cuantitativas para la determinación de etanol.

-         Realizar el dopaje de alcohol en diferentes muestras y  ver su correlatividad en sangre.

-         Conocer las  diferentes técnicas para la determinación de semen.

-         Aprender a correlacionar los hallazgos médico-legales para le elaboración

-         Interpretar los resultados de las técnicas aplicadas.

 

Determinación de semen

 

Pretratamiento de la muestra:

 

Se macerará el hisopo (o la muestra que correspondiera) con unos mililitros de solución fisiológica, luego se centrifuga:

-          Culot : se realiza extendido ( en caso de que ya no lo hayan enviado) se observa en fresco y se colorea con May Grunwald Giemsa. Se observa al MO en busca de espermatozoides.

-          Sobrenadante: se realizan la determinación de Fosfatasa Ácida Prostática y Antígeno Prostático Específico.

 

 

Fosfatasa Acida Prostática (FAP)

 

El esperma contiene una elevada proporción de fosfatasa ácida (400 a 8000 unidades por ml) por lo cual se usa esta propiedad para identificación de manchas de semen.

La fosfatasa ácida es cualquier enzima capaz de hidrolizar un fosfato orgánico en medio ácido. Se denomina fosfatasa ácida prostática a la existente en el plasma seminal, que produce la hidrolisis de la fosforil colina en ácido fosfórico y colina. Esta enzima actúa preferentemente a  pH 5, aunque el mismo varía de acuerdo con el éster fosfoórico a hidrolizar entre 4,5 y 5.

La actividad fosfatásica se miden en base a una reacción en la que se liberan los productos fenólicos.  El aumento de fosfatasa ácida prostática en el suero sanguíneo es patognomónico del cáncer metastático de próstata, por lo cual el dosaje de dicha enzima en el suero sanguíneo es de suma importancia diagnóstica. Se ha demostrado que la Fosfatasa ácida prostática es inhibida por el ácido L (+) tartárico, en tanto que la sanguínea no lo es.

Entonces este método se basa en dos hechos : 1- la excepcionalmente alta actividad de la fosfatasa ácida presente en el semen humano es de origen prostático y por lo tanto independiente de los espermatozoides:

                                                                                     2- Tal enzima es inhibida en forma prácticamente total por el L(+) tartrato 0,04 M

 

Reactivos:

-Buffer de citrato (pH 4,9)

Acido Cítrico Monohidratado…………………….. 18,9 gramos

Agua destilada……………………………………………..500 ml

Hidróxido de Sodio 1N…………………………………  180 ml

Acido Clorhídrico 0,1 N ………………………………... 100 ml

Ajustar el pH a 4,9 y llevar a 1000 ml con agua destilada.

Conservar en heladera.

-Tartrato 0,4 M

Acido L (+) Tartárico …………………………………6,004 gramos

Agua destilada …………………………………………50 ml

Hidróxido de sodio 2N………………………………35 ml

Ajustar a pH a 4,9 y llevar a 100 ml con agua  destilada.

Conservar en heladera.

-Reactivo I (sin tartrato)

Alfa- naftil fosfato sódico……………………….. 50 mg

Buffer de citrato …………………………………….. 50 ml

Disolver en el momento del uso

Fast Blue B………………………………………………. 50 mg

Disolver por fuerte agitación.

 

 

 

 

 

 

-Reactivo II ( con tartrato)

Alfa naftil fosfato sódico…………………………….. 50 mg

Buffer de citrato …………………………………………. 45 ml

Tartrato 0,4 M……………………………………………… 5 ml

Disolver. En el momento del uso de agregar:

Fast Blue B…………………………………………………..  50 mg

Disolver por fuerte agitación

 

Procedimiento:

La prueba se puede realizar en tubo o en placa de toque. Se prepara blanco con agua, testigo y la muestra.

En placa de toque en los dos pocillos de la primera se coloca, una gota de agua, en la segunda hilera se coloca una gota del testigo en cada pocillo y en la última hilera una gota de la muestra.

Al blanco, testigo y la muestra de la primera fila se le coloca el reactivo I (sin tartrato), y a todos los pocillos de la segunda fila se coloca una gota del reactivo II ( con tartrato).

Si en la muestra con el reactivo I se produce color púrpura, había fosfatasa ácida. Si ésta no se desarrolla el examen  es negativo, pudiendo descartarse la presencia de semen.

Si la muestra con el reactivo II, no desarrolla color, la fosfatasa ácida es de origen prostático.

Si con ambos reactivos se desarrolla color púrpura  la fosfatasa ácida es de origen no prostático, y se descarta la presencia de semen humano.

Este método es adecuado para el examen de manchas seminales aún en caso que se tratara de semen aspérmico o de semen mezclado con otras secreciones humanas, pues no se ha hallado otras fosfatasas ácidas de origen humano que sea inhibida por el L(+) Tartrato. Constituye una excepción, rarísima por otra parte, la sangre de un hombre afectado por un tumor metastático de próstata.

 

 

Antígeno Prostático Específico (PSA)

 

 

Es un inmunoensayo cromatográfico para la rápida detección semicuantitativa de PSA. Este contiene dos anticuerpos monoclonales anti PSA como componentes activos. La sensibilidad del test es de 2 ng/ml.

 

   

 

 

 

Interpretación de resultados:

-          En casos que se observe un espermatozoide entero por MO no es necesario la realización de las demás determinaciones.

-          Cuando no se observan espermatozoides por MO, se deben realizar las demás pruebas:

FAP (+) y PSA (+) = Presencia de Semen

FAP(-) y PSA (-) = Ausencia de Semen

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Método de Microdifusión:

 

FUNDAMENTO DEL MÉTODO: Se basa en el proceso de partición, por el cual una sustancia volátil pasa, a través de la atmósfera generada en un dispositivo cerrado, a un solvente puro o a un reactivo en el cual es considerablemente más soluble que en la muestra que lo contiene.

 

Este proceso de partición puede ser favorecido y/o acelerado por el empleo de un reactivo liberador.

El dispositivo más comúnmente utilizado para este tipo de procedimiento es la Cápsula de Conway, la cual consta de dos compartimientos: uno interno, más pequeño y otro externo, más grande. Como norma general, en el compartimiento interno se coloca el reactivo o el solvente puro (K2Cr2O7) sobre el cual se disolverá el tóxico volátil que se investiga (CH3CH2OH). En el compartimiento externo se coloca la muestra sospechosa de contener el tóxico objeto de nuestro estudio y el reactivo que actúa como agente liberador (K2CO3).

3 C2H5OH + 2 K2Cr2O7 + 8 H2SO4 3 CH3COOH + 2 Cr2(S04)3 + 2 K2SO4 + 11 H20

                        naranja                                                       verde

Las muestras que se pueden utilizar son sangre, orina, saliva y otros fluidos biológicos.

 

Las ventajas que ofrece éste método son:

-          Se necesita escasa cantidad de muestra para realizar el ensayo.

-          No necesita procesos previos de purificación, se trabaja directamente con la muestra problema.

-          Es un método muy sencillo, económico y rápido.

-          Es un método de elevada sensibilidad, lo cual acarrea falsos positivos.

Las sustancias susceptibles de ser analizadas pueden ser liberadas de la muestra por distintos principios físico-químicos, ya sea aprovechando la mayor solubilidad del tóxico en el reactivo al que se lo enfrenta; o por reducción de la solubilidad del tóxico en la muestra que lo contiene.

 

MATERIALES UTILIZADOS:

-          Cápsula de Conway (c/tapa).

-          Grasa de siliconas.

-          Pipetas graduadas – Propipeta.

-          Estufa

REACTIVOS UTILIZADOS:

-          Dicromato de potasio 0,4N en ácido sulfúrico 10N.

-          Solución saturada de Carbonato de potasio.

-          Testigos de concentración conocida (T1: 1g/l; T2: 2g/l; T3: 3g/l).

 

PROCEDIMIENTO:

1-     En el compartimiento interior se coloca 0,5ml de la solución de K2Cr2O7 (agente atrapante).

2-     En el compartimiento externo se agrega la muestra (o agua o testigos cuando corresponda) más 1ml de la solución de K2CO3 (agente liberador).

3-     Cubrir la placa con la tapa rotulada correspondientemente, previa lubricación con grasa de siliconas en los bordes para evitar que los gases difundan al exterior de la cápsula. Agitar suavemente sobre una superficie plana, con movimientos circulares hasta homogeneizar los agregados.

4-     Dejar reaccionar aprox. 2hs a 50°C.

 

 

Blanco

Testigo 1

Testigo 2

Testigo 3

Desconocido

K2Cr2O7

0,5ml

0,5ml

0,5ml

0,5ml

0,5ml

K2CO3

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

H20

1ml

-

-

-

-

Testigo 1

-

1ml

-

-

-

Testigo 2

-

-

1ml

-

-

Testigo 3

-

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